免疫检查点阻断(ICB)、个性化肿瘤疫苗和溶瘤病毒疗法等免疫疗法的出现是抗肿瘤治疗史上的一个里程碑。不幸的是，免疫治疗只对有限的癌症类型有效，患者很可能在短时间内产生耐药性。最近的研究表明，在大多数实体癌中，高的肿瘤突变负荷不能作为预测ICB应答的精确生物标志物。因此，需要免疫治疗结果的预测性生物标志物。然而，对于免疫治疗如何改变免疫微环境，以及它如何通过肿瘤-非肿瘤细胞相互作用发挥作用，我们知之甚少。肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)是肿瘤微环境(trrenvirnent，TME)的重要组成部分，影响预后和临床特征，在肿瘤免疫治疗中发挥基础性作用。因此，对TILs进行全面、动态的监测有助于进一步探索肿瘤免疫治疗的边界。
测序技术为细胞生物学、疾病病原学和药物反应提供了新的见解。批量测序研究以整个肿瘤为靶点，分析肿瘤内细胞的平均基因表达。然而，反映TME潜在异质性和可塑性的特定功能亚群可能被忽视。肿瘤主要由肿瘤细胞、间质细胞和免疫细胞组成，这些细胞可分为不同的亚型。这些细胞构成了肿瘤异质性，在肿瘤进展中起主要作用。RNA-seq的存在可以通过分析和量化单个细胞的整个转录组来探索肿瘤异质性。对于单个细胞，其遗传学和表观遗传学被揭示来预测其在癌症中的作用和对治疗的反应。此外，基于单个细胞的空间转录揭示了单个细胞在原始肿瘤中的空间位置和细胞间通讯的局部网络。
最近，许多癌症类型的免疫环境，如黑色素瘤，乳腺癌，肝癌，非小细胞肺癌，已经被RNA-seq揭示，其中T细胞，B细胞，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)，树突状细胞，它们分泌的细胞因子趋化因子构成了一个复杂的相互作用网络。令人印象深刻的是，T细胞一直是研究抗肿瘤功能的主要焦点，包括n?veT细胞、效应记忆T细胞、衰竭T细胞、调节性T(Treg)细胞和居住记忆T细胞，这些在几种癌症中都有描述。B细胞作为体液免疫的主要效应体，在TME成分和免疫治疗反应中也有显著作用。大量RNA测序显示，B细胞相关标记物在免疫治疗应答者和非应答者之间表达差异最大。B细胞以三种方式攻击癌症:1.分泌免疫球蛋白介导抗体依赖性细胞毒性()、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC);2.抗原提呈激活T细胞;3.分泌GrnzyeB、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和IFNγ直接杀伤肿瘤细胞。因此，肿瘤浸润B细胞(TIL-Bs)可能对肿瘤预后有重要意义，并可作为预测免疫治疗的生物标志物。然而，专注于B细胞的研究比专注于T细胞的研究要少得多，这使得它们在癌症免疫治疗中的复杂机制不清楚。随着RNA-seq技术的发展，TIL-Bs的位置和功能可以被精确地确定，这可能有助于更好地理解其机制。从单细胞的角度来看，在本文中，我们讨论TIL-Bs亚种群分化轨迹，与其他细胞的相互作用，并总结B细胞的机制调节时间和影响免疫治疗效果，旨在为肿瘤研究提供一种新的方式针对B细胞。
单细胞测序可以进一步探索肿瘤内的异质性。与流式细胞术、质谱法或其他任何以前的方法不同，单细胞测序是一种连续的方法，而不是离散的方法。RNA-seq的步骤主要包括以下四个步骤:(1)单细胞分离，(2)反转录DNA，(3)PCR扩DNA，(4)测序库构建(图1)。荧光激活细胞分选(FACS)可用于从组织中分离特定的细胞(图1)。在B细胞研究方面，采用流式细胞术筛选CD45+细胞，增加B细胞的比例；也可根据B细胞标记物直接选择靶向B细胞。作为RNA-seq技术的突破，微流控系统将单个细胞封装在独立的微液滴中，该微液滴包含一个独特的分子标识符(MI)，用于对单细胞内的微转录材料进行条形码。根据每个细胞的MI，即使细胞被裂解，在后续的分析中也可以找到转录信息。基于这一特点，10×GensChri平台同时测序数千个细胞。与Srt-seq2等低通量方法相比，10×GensChri平台因其成本低、效率高而被更广泛地应用于B细胞检测。
在对多种RNA-seq方法的比较研究中，10×Gens也比其他高通量方法如Drp-seq和Indrps[33]具有更高的灵敏度，更高的与线粒体基因匹配的reds比例，更低的噪声。利用10×Gens和Srt-seq2平台，可以通过不同的免疫球蛋白重链特征区分CRC中B细胞的亚群，聚类结果无明显差异。但是，10×Gens也有不足之处，它不能覆盖所有的基因，并且存在3''区域偏倚，在检测基因突变或RNA剪接位点时可能会遗漏一些重要信息。此外，这种方法对细胞质量有更高的要求，不同的组织和不同的获取样本的方法都不同。利用RNA-seq，我们可以更精确地定义细胞的亚型，追踪它们的发育谱系，确定克隆型和表现型之间的关系，绘制不同细胞之间的相互作用和空间关系图，从而从多个维度描述TME。此外，还需要通过一系列体内和体外实验来验证结果。我们总结了使用RNA-seq研究的最新出版物
B细胞受体(ellreptr，BCR)是一种能识别并结合特异性抗原的膜免疫球蛋白，在B细胞的分化成熟过程中起着重要作用。BCR由两条重链和两条轻链组成，其中可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因序列的重组创造了B细胞的多样性。这种多基因的复杂性使得鉴别不同的受体变得困难。然而，由于每个B细胞通常表达一个单一的受体，潜在的抗原特异性受体可以通过给定的原细胞链发现。BCR的两个主要功能如下。首先，它通过诱导B细胞激活过程中肌动蛋白骨架的实质改变和各种基因的表达来激活B细胞。其次，它介导抗原的鉴定和提取，从而导致加工过的肽在主要组织相容性复合体II(MHCII)上呈现给T辅助细胞。因此，BCR测序有助于进一步了解B细胞分化的轨迹及其特异性识别抗原性的机制，特别是当与单个B细胞的完整转录组身份配对时，这为了解癌症的发展提供了线索。更重要的是，BCR测序可以追踪来自单细胞的群体，揭示克隆型和表型之间的关系。RNA-seq技术在BCR测序中具有天然优势，因为含有MI的微流控系统可以保证同源VH-VL配对的保存，而这些同源VH-VL配对在B细胞批量测序中可能会丢失。BASIC是一个在单细胞分辨率上进行BCR测序的平台。作为重建配对全长BCR序列的工具，BrCeR为B细胞的克隆推断和谱系追踪提供了一个完整的管道。LIBRA-seq是一种高通量的方法，将BCRse-序列与其同源抗原特异性连接起来，可以用来绘制特定对象中数千个B细胞的抗原特异性。
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